实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，简称qPCR。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的进步，可以对DNA、RNA样品进行定量分析。

qPCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使用荧光信号积累从而实时反应整个PCR进程，最终通过标准曲线模板对未知样本检测结果进行定量分析的一个进程。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）实验流程可分为：①样本采集→②RNA提取→③RNA质量鉴定→④反转录成cDNA→⑤PCR扩增→⑥数据分析。

对应操作流程中纯水的应用：

qPCR实验用水要求

qPCR实验推荐使用的超纯水水质要求：

电阻率：18.2MΩ·cm@25℃；

TOC：＜5ppb；

微生物：＜0.01cfu/ml；

DNAse &RNAse：无。

在上述实验流程中，引物稀释、Buffer稀释和配置、补足反应体系等都会用到纯水，纯水的水质将直接影响最终数据分析实验结果的准确率。

水中的有机物、离子含量、微生物、颗粒物等杂质都会给实验带来影响，一般qPCR实验中的纯水应用会更加关注以下两种指标。

一、DNA酶&RNA酶

DNA酶和RNA酶一般指DNA水解酶与RNA水解酶，DNA酶可使DNA主链上的磷酸二酯键水解，而RNA酶可作用于RNA的脱氧核糖核酸之间的连接键，二者的左右都会造成DNA和RNA水解，会直接影响实验的最终结果。

在进行qPCR实验时，保证提取的RNA和DNA样本的完整性十分关键，尤其在提取RNA的时候，RNA极易被降解，所以去除这两种酶也成为了保证qPCR实验的关键。如果样本中的核酸被降解，会影响检测结果的准确性，容易造成假阴性检测结果，如在新冠病毒的核酸检测过程中出现假阴性，可能会对疫情防控带来不可控的隐患。

因此，qPCR实验的实验用水必须有效降低DNA酶和RNA酶的含量，以减少对实验结果的影响。

二、镁离子

qPCR实验中，针对不同的引物和相应的模板，需要确定合适的镁离子浓度。

如果镁离子浓度过高，会增加引物二聚体的形成，直接影响特异性。如果镁离子浓度过低，则会影响DNA聚合酶的活性，导致产量降低，影响实时定量的敏感性。

所以qPCR实验中使用的超纯水必须控制镁离子浓度，从而避免背景因素所带来的不可控因素。

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